用户文章：RIP-seq和m6A-seq联合分析揭示头颈癌铁代谢机制 | RIP专题

中文标题：YTHDF1增强铁代谢依赖于TFRC m6A甲基化

英文标题：YTHDF1-enhanced iron metabolism depends on TFRC m6A methylation

发表期刊：Theranostics

影响因子：8.579

研究机构：浙江大学医学院附属邵逸夫医院

联川提供：RIP-seq， m6A-seq，转录组测序，联川生物云平台omicstudio（包括GSEA分析、四象限图、韦恩图、火山图、热图、GO/KEGG富集分析、）

1. 研究背景

在头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中，下咽鳞状细胞癌（HPSCC）的预后最差。铁代谢在肿瘤的发展中起着至关重要的作用，主要受基因的改变和转录后过程的调控。N6甲基腺苷（m6A）修饰的最新发现扩大了真核生物中以前未发现的转录后基因调控机制的新领域。许多研究表明，m6A甲基化是致癌性和肿瘤增殖中表观遗传失调的独特表现。但是，HPSCC中m6A修饰和铁代谢的状态仍然未知。

2. 研究方法

本研究开展了生物信息学分析，样品分析和转录组测序，以评估m6A修饰与铁代谢之间的相关性。进行了铁代谢和细胞生物学分析以评估m6A reader YTHDF1对HPSCC增殖和铁代谢的影响。覆盖整个转录组的m6A-seq和RIP-seq数据以探索YTHDF1在HPSCC中功能的分子机制。

3. 结果展示

3.1 YTHDF1与HPSCC的铁代谢密切相关

作者首先挖掘了TCGA数据库中铁代谢相关基因后，找到了ACO1、CYBRD1、FTH1、FPN、HAMP、转铁蛋白受体TFRC等基因。接下来通过m6A测序（联川生物提供）进一步佐证了这些基因同时在m6A水平存在修饰差异。

通过血清铁蛋白浓度测定，血清铁蛋白和YTHDF1表达之间存在显著的正相关。免疫组化及MRI影像学监测也从侧面证实了铁含量与YTHDF1正相关。

YTHDF1敲除前后的转录组测序（联川生物提供）结果，进一步利用联川生物云平台中的GSEA分析模块进行数据挖掘，揭示了大量与肿瘤侵袭性、迁移和Myc原癌基因蛋白相关的基因存在差异表达。

总之，这些数据表明，YTHDF1可以促进HPSCC的肿瘤进展和铁代谢。

3.2 m6A-seq、转录组、RIP-seq联合分析锚定YTHDF1靶基因

m6A测序结果表明YTHDF1敲除前后，样本中m6A水平并未出现显著差异。这时候作者对YTHDF1进行了YTHDF1-RIP-seq（联川生物提供）后挖掘到了>2000个 candidate靶基因，通过与转录组及m6A测序进行取交集的韦恩图分析后发现，取交集后靶基因有706个，其中264个出现了下调。

对这些基因进一步通过GO、KEGG、GSEA分析后，逐步缩小范围，锚定到了第一部分TCGA分析结果中已经出现的候选基因中。包括CIAO1，TFRC，TET2，CYP2U1，EPAS1和SLC25A28作为候选基因要进入下一步研究，并用IGV对这些候选基因在多个组学中的peak峰信号值进行了可视化展示（IGV和Adobe AI制作RIP-seq Peak图简易教程 | m6A专题）。

在开展实验之前，作者还利用了中山大学肿瘤防治中心左志向和郑健课题组开发的m6A2target数据库（m6A2Target:不做RIP也能预测m6A酶靶基因 | RIP专题）进行进一步交叉验证，逐步锁定到了TFRC。

3.3 TFRC是YTHDF1促进铁代谢的重要靶基因

m6A发挥作用的主要机制是由m6A结合蛋白决定的。作者进行了功能性实验，用对照或过表达TFRC的质粒转染WT和YTHDF1基因敲低的HPSCC细胞。TFRC的异位表达可部分恢复YTHDF1基因敲低细胞的生存能力和异种移植瘤生长（图6C）。TFRC的下调也导致YTHDF1诱导的细胞活力和迁移增加。这些结果强烈表明，TFRC是HPSCC细胞中YTHDF1的关键靶基因。

 TRFC过表达恢复了YTHDF1敲低细胞的细胞内铁含量，Fe²⁺水平和ROS水平的降低。此外，TFRC的下调显着降低了细胞中YTHDF1介导的铁含量，细胞内Fe²⁺水平和ROS水平的升高。WB结果表明TFRC的下调也减少了YTHDF1诱导的STEAP4和FTH1蛋白质水平的增加，TRFC过表达恢复了YTHDF1敲低细胞中STEAP4和FTH1的蛋白质水平。

总之这些证据表明TRFC介导HPSCC细胞中YTHDF1的铁调节功能。 

4. 研究结果与结论

本研究在HPSCC患者中发现YTHDF1与铁蛋白水平和肿瘤内铁浓度密切相关。YTHDF1诱导的HPSCC肿瘤发生取决于体内铁代谢。从机制上讲，YTHDF1甲基转移酶结构域与TRFC mRNA的3'UTR和5'UTR相互作用，然后进一步正向调节m6A修饰的TFRC mRNA的翻译。功能获得和功能丧失分析证实了这一发现，表明TFRC是YTHDF1介导的铁代谢增加的关键靶基因。YTHDF1通过m6A依赖性机制增强了HPSCC中TFRC的表达。从治疗的角度来看，靶向YTHDF1和TFRC介导的铁代谢可能是一个有前途的策略用于治疗HPSCC。

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